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题名: 纳米银的神经毒理学效应研究
作者: 殷诺雅
学位类别: 博士
答辩日期: 2014-11
授予单位: 中国科学院研究生院
授予地点: 北京
导师: 江桂斌
关键词: 纳米银 ; 神经毒性 ; 凋亡 ; 钙离子通道蛋白 ; 维生素E,Silver nanoparticles ; neurotoxicity ; apoptosis ; calcium ion channel ; vitamin E.
其他题名: Neurotoxicological effects of silver nanoparticles in vitro and in vivo
学位专业: 环境科学
中文摘要:       纳米银,由于其优良的物理化学性质,其应用领域涵盖生物、医药、化工等。随着纳米银产品的普及使用,纳米银的使用安全性以及其带来的生物学效应引起了人们 的关注。特别是纳米银对中枢神经系统的毒性效应,成为当下研究热点之一。通过体外细胞实验及体内动物实验,我们研究了纳米银的神经毒性效应及其内在致毒机 制,一方面为纳米银的生产应用提供了安全性评价数据,另一方面也为纳米材料神经毒性效应研究构建了很好的研究方法体系。
      首先,使用原代大鼠小脑颗粒神经元(cerebellum granule cells, CGCs)作为细胞模型,评价纳米银在体外细胞水平上的神经毒性效应,并阐明其作用机制。实验结果说明,纳米银以剂量相关式显著抑制神经细胞活力,表现出 明显的神经毒性,然而在纳米银造成神经细胞毒性的同时,对细胞膜不具有损伤作用,表现为细胞外LDH水平不变。使用Annexin V-FITC/PI双染的方法对纳米银暴露后的CGCs进行流式细胞术分析,发现纳米银可导致神经细胞凋亡。通过ELISA实验证实,纳米银暴露造成 CGCs细胞内凋亡执行蛋白—caspase-3活化,细胞凋亡通路启动。与此同时,对纳米银暴露后的CGCs细胞内氧化应激水平进行监测,实验结果表 明,纳米银可造成CGCs细胞内活性氧(ROS)水平大幅上升、伴随抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)含量下降,同时神经细胞内钙库释放钙离子,细胞内持续保 持较高钙离子水平,说明纳米银可通过氧化应激途径干扰细胞正常抗氧化系统,使细胞长时间处于应激状态,从而发生神经毒性。细胞毒性研究最终通过 western blot实验再次确证,纳米银暴露可激活神经元CGCs细胞内的caspase-3,使其活化并产生活性小片段,进一步激活下游凋亡相关蛋白,使凋亡信号 被级联放大,最终导致细胞死亡。
      研究进一步基于活体大鼠动物模型,开展了纳米银神经毒性效应进行评估与作用机制探讨。实验采用新生SD大鼠,模拟临床纳米银用药途径,对实验动物进行为期 三个月的鼻腔滴注给药,评价纳米银暴露对动物神经行为学的影响。Rotarod转棒模型测试中,纳米银暴露组出现动物转棒坠落潜伏时间(latency time)降低,说明动物运作协调性下降;Open Field旷场模型测试中,在相同测试条件下,纳米银暴露组实验动物的运动总程、平均运动速度、穿越中心场区次数、站立次数等指标显著低于对照组,而动物 的休息时间增加,证实纳米银暴露SD大鼠可导致动物的自发活动受到抑制。进一步对纳米银暴露后大鼠小脑组织进行病理学检查,发现在小脑颗粒细胞层出现严重 的损伤情况,小脑组织病变不容忽视;结合动物行为学实验数据,纳米银暴露导致实验动物运动协调能力降低,表现为小脑性共济失调样症状。通过western blot对小脑性共济失调相关钙离子通道蛋白CACNA1A以及钾离子通道蛋白KCNA1水平进行检测,结果发现,纳米银造成实验动物的神经毒性,是通过 降低小脑内电压依赖性钙离子通道蛋白水平实现的,与钾离子通道蛋白无关,此结果从蛋白水平层面确认了纳米银造成小脑共济失调症状的发生。
      维生素E(Vitamin E, VE)作为一种优良的抗氧化剂,可直接与细胞内自由基作用,清除氧化物质并保护细胞不受损伤,而纳米银的致毒机制中,氧化损伤是最主要的一条途径。在纳米 银神经毒性拮抗实验中,选择VE作为拮抗剂,重点研究VE对纳米银造成神经毒性效应的改善情况。首先通过原代大鼠小脑颗粒神经元CGCs作为细胞模型,体 外筛选VE给药浓度并初步确认其拮抗作用,通过一系列实验证实,VE可清除细胞内活性氧ROS并有效抑制纳米银造成的细胞活力降低,VE通过对钙离子通道 蛋白相关基因Cacna1a进行保护,从而使CACNA1A蛋白含量不受纳米银暴露影响。从细胞实验数据初步推断VE具有很好的拮抗纳米银神经毒性效应的 能力。进一步实验仍使用新生SD大鼠作为动物模型,评价在活体水平上VE对纳米银造成神经毒性效应的拮抗作用。实验结果证明,口服VE可显著改善由纳米银 暴露引起的动物体重下降、运动协调性降低和自发活动抑制,并且VE能通过清除脑内自由基、抑制脂质过氧化发生,从而对脑组织结构起到一定的保护作用,VE 还可在活体水平上抑制纳米银造成的小脑内电压依赖性钙离子通道蛋白含量降低。综合各项数据,VE作为有效的自由基清除剂,可显著改善纳米银造成的神经毒性 的发生。
英文摘要:
      Silver nanoparticles (AgNPs) are emerging as one of the fastest growing nanotechnology product categories. However, the impact of silver nanoparticles (AgNPs) on the central nervous system is a topic with mounting interest and concern and the facts remain elusive. This work focused on the in vitro and in vivo neurotoxicity of silver nanoparticles. The aim of our work is to assess the biological safety of silver nanoparticles, provide basic data for their applications and establish feasible methods to investigate the neurotoxicological effects of nanomaterials.
      First, the neurotoxicity of commercial AgNPs to rat cerebellum granule cells (CGCs) and the corresponding molecular mechanism are closely investigated. It was demonstrated that AgNPs induced significant cellular toxicity to CGCs in a dose-dependent manner without damaging the cell membrane. Flow cytometry analysis with the Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) staining indicated that the apoptotic proportion of CGCs upon treatment with AgNPs was greatly increased compared to the negative control. Moreover, the activity of caspase-3 was largely elevated in AgNP-treated cells compared to the negative control based on the ELISA assay. AgNPs were demonstrated to induce oxidative stress, reflected by the massive generation of reactive oxygen species (ROS), the depletion of antioxidant glutathione (GSH), and the increase of intracellular calcium. Western blot assay suggested the activation of caspase-3, indicating caspase-dependent apoptosis was induced in response to AgNPs treatment. Taken together, it is demonstrated that AgNPs substantially impaired the survival of primary neuronal cells through apoptosis coupled to oxidative stress, depending on the caspase activation-mediated signaling pathway.
      Based on in vitro studies, we futher evaluated the in vivo toxicity of silver nanoparticles. The neonatal SD rats, as the animal model, were administered with AgNPs by intranasal instillation. We demonstrated that 3-month AgNPs exposure caused cerebellar ataxia like symptom in SD rats which was evidenced by dysfunction of motor coordination and impairment of locomotor activity. Observation of cerebellum section revealed that AgNPs could provoke destruction of cerebellum granular layer with concomitant proliferation or activation of glial cells. AgNPs treatment decreased the calcium channel protein (CACNA1A, or Cav2.1-α1A-subunit) levels in cerebellum without changing the potassium channel protein (KCNA1) levels. In vitro experiments showed that AgNPs treatment significantly reduced the expression of CACNA1A in CGCs.
      As an antioxidant, vitamin E (VE) was demonstrated to antagonize the neurotoxicity of AgNPs both in vitro and in vivo through the depletion of oxidative damage. Taken together, AgNP-induced rat motor dysfunction is associated with decreased expression of CACNA1A and introduction of vitamin E (VE) was able to efficiently attenuate the abnormal neuronal penotype through antagonizing oxidative stress caused by the nanoparticles.
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/34536
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殷诺雅. 纳米银的神经毒理学效应研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2014.
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