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题名: 高等真核生物 DNA N6-甲基腺嘌呤修饰分析与功 能研究
作者: 黄华
学位类别: 博士
答辩日期: 2016-05
授予单位: 中国科学院研究生院
授予地点: 北京
导师: 汪海林
关键词: 6甲基腺嘌呤脱氧核苷酸,果蝇 6mA去甲基化酶,早期胚胎, 异染色质,白藜芦醇,5羟甲基胞嘧啶,α酮戊二酸 ; N6-methyladenine, DMAD, Early embryo, Heterochromatin, Resveratrol, 5hmC, αKG
其他题名: DNA N6-Methyladenine modification in high eukaryotes
学位专业: 环境科学
中文摘要:       在哺乳动物体内,5-甲基胞嘧啶(5mC)被认为是唯一的DNA甲基化形式,可调控基因表达和多种生物学功能。5mC通过Fe(II)和 α-酮戊二酸(αKG)依赖的TET双加氧酶催化氧化,生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),并可进一步氧化形成5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。5mC及其氧化产物与TET蛋白共同调节多种生理功能,如核重新编程、胚胎发育、细胞分化、疾病的发生发展等。与哺乳动物不同,原核生物存在三种  DNA甲基化形式,5mC、N4-甲基胞嘧啶(4mC)和N6-甲基腺嘌呤(6mA)。其中,6mA是主要的原核生物  DNA甲基化形式。对一些细菌而言,6mA缺乏将导致其死亡。一些低等单细胞真核生物也存在 6mA  DNA修饰。令人惊奇的是:高等真核生物基因组中是否存在6mA修饰一直是一个悬而未决的科学难题。我们设想:1)过去所使用的分析技术和方法的检测灵敏度低,难以检测低丰度的 6mA;2)6mA可能分布于特定组织或特定发育阶段而难以探知;3)由于快速去甲基化, 6mA在体内高度动态变化而仅在短时间内出现。基于以上原因,人们难以确定高等真核生物中 6mA的存在。
    为了回答上述科学难题,我们通过与中科院动物所陈大华研究组合作,以经典的模式生物果蝇作为研究对象考察 6mA的存在与可能的分布。在果蝇体内,5mC存在与否一直存在争议。我们设想,果蝇体内可能存在另外的DNA修饰,如6mA,并通过该修饰实现果蝇体内表观基因组调控。首先,我们发展了基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)的高灵敏分析方法,可检测16mA/108 dA。利用该方法,我们发现 6mA修饰在果蝇体内多个组织基因组中广泛存在。液相色谱联用高分辨飞行时间质谱(LC-QTof)分析,显示可能的果蝇6mA组分的精确分子质量为 266.1250au,与 6mA标准品标准分子质量(266.1248au)偏差仅为 1.02ppm。另外,果蝇6mA组分分子峰碎裂模式和各个碎片(21碎片)准确质荷比,与标准 6mA化合物均一致,进一步确定了6mA的存在。
    利用 UHPLC-MS/MS分析,发现果蝇在早期胚胎发育过程中6mA是高度动态变化的。0.75小时胚胎阶段,6mA修饰高达~0.07% 6mA/dA);4-16h胚胎阶段,6mA的含量约下降至0.001% (6mA/dA)。这些结果显示随着胚胎发育的进行,6mA含量出现急剧下降,说明在胚胎发育后期  DNA  6mA去甲基化机制可能发挥作用。活性分析显示后期胚胎细胞核提取液的确存在显著的 DNA 6mA去甲基化活性,预示果蝇存在 DNA 6mA的去甲基化酶。
      哺乳动物体内 TET蛋白家族在  DNA去甲基化过程中发挥重要作用。基因比对显示,果蝇体内存在一种 TET同原蛋白DMAD。DMAD在果蝇胚胎发育期的mRNA和蛋白质表达水平与6mA含量呈现反比关系。DMAD抗体处理的果蝇胚胎细胞核提取液 DNA去甲基化活性显著降低,同时,敲低果蝇胚胎早期DMAD表达会导致胚胎后期 6mA丰度明显提高。另外,敲除DMAD后,果蝇脑部和卵巢组织中6mA出现显著升高(增加10-70倍)。我们通过真核表达系统纯化了DMAD-CD和DMAD-CDmut蛋白,并建立DMAD的体外去甲基化反应体系。通过该体系,我们发现 DMAD-CD在体外具有明显6mA去甲基化活性,并具有明显剂量与效应关系,但DMAD-CDmut并没有显示去甲基化活性。因此我们确定DMAD是果蝇体内主要的  6mA去甲基化酶。
    我们利用 6mA特异性抗体对野生型和  DMADdel果蝇基因组  DNA进行免疫沉淀,然后进行高通量二代测序分析。结果显示,在  DMADdel果蝇的卵巢中,6mA主要富集于转座子区域,表明在果蝇体内  6mA修饰可能与转座子表达调控有关。
    在开展模式生物果蝇研究之前,我们就已着手研究哺乳动物基因组中的6mA修饰。我们发现,在成年小鼠的脑、肺、肾、脾等组织基因组  6mA修饰含量非常低,约 5-25 6mA/108  dA。通过与同济大学合作,我们进一步探讨小鼠生殖细胞和早期胚胎发育阶段基因组 6mA修饰。结果表明,在小鼠卵母细胞内存在较高丰度 6mA修饰(0.03%,6mA/dA),是其它组织基因组的 1200-6000倍。令人奇怪的是,精子中却没有检测到 6mA修饰。体外培养受精卵,发现在胚胎二细胞时期 6mA的丰度达到最高(0.18%,  6mA/dA)。随着发育继续进行,6mA丰度出现急剧下降。至囊胚期时,6mA丰度为0.004% (6mA/dA)。免疫荧光成像分析表明,在小鼠生殖细胞和早期胚胎中,6mA主要分布于异染色质区域,暗示6mA在小鼠体内的存在可能与基因沉默有关。
    与此同时,我们探讨了白藜芦醇对细胞 DNA羟甲基化的影响。已有研究表明,长期摄入一定剂量白藜芦醇对多种疾病具有预防作用,例如高血压和癌症。DNA羟甲基化是否有所贡献尚不清楚。利用小鼠胚胎干细胞(mESc),白藜芦醇暴露可显著提升细胞内的 5hmC和5fC的含量,约为对照的  1.8-2.1倍。利用发展的 LC/MS/MS方法,分析细胞裂解液中α-酮戊二酸  (αKG)和二羟基戊二酸(2HG)的含量。结果显示,白藜芦醇处理可显著提升细胞αKG水平,约为对照组的 8倍,而  2HG的含量没有显著变化。该结果说明白藜芦醇可能通过提高细胞内 αKG含量来增强   Tet蛋白的活性,从而使  5hmC的含量增加。该过程表明白藜芦醇可能影响细胞内 DNA羟甲基化和能量代谢过程。
英文摘要:     5-methylcytosine(5mC),  which   was  thought   to  be   the  only  form   of  DNA methylation  in  mammals,  play critical  roles  in  regulation  of  gene  expression  and modulation  of   diverse  biological  functions.   Fe(II)-  and  α-ketoglutarate   (α-KG)-dependent   ten-eleven  translocation(TET)   family   dioxygenases   can  catalyze   the oxidation  of  5mC    tto  form   5hmC,  and  iterately  to  5-formylcytosine  (5fC)  and 5-carboxylcytosine  (5caC).  Tet  proteins  and  their  functions  in   oxidation  of  5mC together   display   important   biological   process   in   mammals,   including   nuclear reprogramming, embryo development,  cell differentiation and stemness,  and diseases occurrence    and   development.    Interestingly,    three   DNA    methylations,   5mC, N4-methylcytosine  (4mC)  and N6-methyladenine  (6mA),  are  found  in prokaryote.Among these DNA methylations, 6mA is the predominant form and  it is vital to some bacteria. 6mA is  also found in some  low unicellular eukaryotes. However,  it remains unclear whether genomic 6mA exists in high eukaryotes. We  reasoned this ambiguity: 1) Analytical  technologies used for  detection of  genomic 6mA in  the previous work are insensitive, so  the trace amount  of 6mA can’t be detected;  2) Genomic 6mA may only exist in certain tissues  or at particular developmental stages: 3) Genomic  6mA is highly  dynamic and  hard  to  be  captured due  to  rapid  and  one-step  demehtylation involved in high eukaryotes.
    In colaboration with  Chen Dahua’s Group, at  the Institute of  Zoology, CAS, We exploited  Drosophila to  investigate  the 6mA  existence and  distribution  in genome. Intriguingly, over a  decade, it is controversial  whether 5mC is present  in Drosophila.We  hypothesized  that  DNA methylation  other  than  5mC  could  occur,  e.g.,  6mA,which  alternatively functions  in  epigenetics  of Drosopholal.  First,  we  developed a ultra-high  performance liquid  chromatography-triple  quadrupole  mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) analysis method, which  can detect genomic6mA of 1 modification per  108 deoxyadenine  dA).  By taking  advantage  of  this sensitive  method,  we  can detect 6mA  in Drosophila.  By characterization  of the peak  fraction containing  6mA obtained from early embryo of drosophila usinga    high-resolution  mass spectrometry the  drosophila 6mA  display  a mass/charge  ratio  of  266.1250 au,  which  match  the theoretic mass  of  6mA (266.1248 au)  with  a deviation  of 1.02  ppm. Moreover,  the measured mass/charge ratios of  the obtained fragment ions (21 fragments) also  match well with  that of  standard 6mA.  All the results  consistently support  the presence  of genomic 6mA in Drosophila.
    The  quantitative   UHPLC-MS/MS  analysis   of  6mA  showed   that  6mA   was dynamic in  Drosophila DNA during  early embryonic  development. The  level of  the 6mA  appeared  to  be~0.07%  (6mA/dA)  at the   ~0.75h stage  but  was  dramatically reduced  to a  very  low  level  (~0.001%, 6mA/dA)  at  the  4–16 h  stages.  The  rapid decrease in genomic  6mA followed by development  of the embryo indicated  that the demethylation  mechanism  played  a  role  at  the  late  stage  of  embryo.  Indeed, the nucleic  extract   of  late  stage   embryo  exhibited  markedly  demethylation   activity, hinting the involvement ofa demethylase in embryonic development stage.TET proteins play a important  role in the demethylation process in  mammals. In Drosophila,  there  is  a  Tet  homologous protei,  which  is  named  6mA  demethylase (DMAD), through sequence  alignment. We observed that  the DMAD expression was antagonistic  to  6mA abundance  and  the  demethylation activity  of  embryo  nuclear extract show a significant decrease after DMAD depletion using anti-DMAD antibody.DMAD Knockout  dramatically  increase the  level of  6mA for  70 folds  in head  and for   10  folds   in   ovary.   The  purified   recombinant   DMAD-CD  protein   showed demethylation  activity  in vitro  22-25%.  In  contrast,  the  DMAD-CDmut could  not remove 6mA in  the DNA substrates.  All these results  suggest that the  DMAD is the Drosophila 6mA demethylase.
     We performed DNA-immunoprecipitation (DNA-IP) coupled with high-throughput DNA sequencing analysis and  observed that more 6mA modification is  present  in  the  transposon  regions  in  DMAD  mutant  ovaries  than  in  wild-type ovaries.The result  suggested that  DMAD-mediated 6mA demethylation  is correlated with transposon expression and this conclusion was confirmed by the RNA-seq data.
    Prior to the investigation of  Drosophila, we set out to investigate the  distribution of 6mA  in mammals.  We found  that  the 6mA  abundance was  extremely low  (4-25 6mA/108dA)  in  gemomic DNA  of  tissues such  as  lung,  heart,  kidney  and spleen,which were obtained  from adult mice. In  late cooperation with Tongji  University, we carryed  out some  further  research to  evaluate  6mA in  the  germ  cell and  the  early embryonic  stages  of  mice.  A  higher  abundance  of  6mA was  observed  in  oocyte (0.03%, 6mA/dA), about 1200-6000 fold compare to  the other tissues. However, 6mA was  not  detected  in  sperm.  The  quantitative  analysisof  6mA  in  the  mouse  early embryo cultured in vitro  showed that 6mA abundance reached to a peak abundance at 2  cell  stage  (0.18%,  6mA/dA)  and  decreased  dramatically  following  the  embryo development  to  blastula   (0.004%,  6mA/dA).  Immunostaining   assays  using  6mA antibody showed  that the 6mA  was rich in  the hereochromatinic  regions both in  the germ cell and  early embryo stage. These results  suggest that 6mA in genome may  be related to gene silencing.
    We also conducted a  preliminary investigation on the influence  of resveratrol on DNA   hydroxymethylation   in    mammalian   cells.   According    to   the    literature,appropriate  long-term  intake  of  resveratrol  is  associated   with  a  reduced  risk  for lifestyle-related diseases such as cardiovascular disease  and cancer. However, it is not know  whether  DNA hydroxymethylation  has  a  role  in  these  protecting  functions.Mass spectrometry analysis demonstrated that 5hmC  and 5fC levels in genomic DNA both significantly increased  (1.8- 2.1 folds) in  wild type mouse embryonic stem  cells (mESc) treated  with 50μM resveratrol  (24h). Moreover, we  developed a LC/MS/MS analysis method  for α-ketoglutarate  (αKG) and  2-hydroxyglutaric (2HG)  in the  cell lysates. we  observed  a significant  increase  (more than  8 folds)  of αKG  in  positive cells  and  no   difference  in  the   abundance  of  2HG.   The  data  demonstrated  that resveratrol  can   enhanceTet  oxidation   activity   by  elevating  αKG.   These  results indicated that the  resveratrol could affect the DNA hydroxymethylation by  impacting energy metabolism in cultured cells.

内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/36804
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黄华. 高等真核生物 DNA N6-甲基腺嘌呤修饰分析与功 能研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2016.
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