中国科学院生态环境研究中心机构知识库
Advanced  
RCEES OpenIR  > 环境化学与生态毒理学国家重点实验室  > 学位论文
题名: 莱茵衣藻对纳米银的生物吸收与转化及 响应机理研究
作者: 王松山
学位类别: 博士
答辩日期: 2016-05
授予单位: 中国科学院研究生院
授予地点: 北京
导师: 张淑贞
关键词: 纳米银,颗粒吸收,生物转化,缺铜反应,转录因子 CRR1 ; silver nanoparticles, cellular internalization, biotransformation, copper deficiency response, transcription factor CRR1
其他题名: Internalization,biotransformation and biological effects of silver nanoparticles in Chlamydomonas Reinhardtii and the related mechanisms
学位专业: 环境科学
中文摘要:     纳米银因具有广谱抗菌活性而在工业生产、日常生活用品和医药卫生中广泛应用,这些产品在其生产和使用过程中存在纳米银的释放风险,导致进入环境中纳米银数量不断增加,并引起人们对纳米银生物安全性和潜在毒性效应的关注,纳米银的环境行为和毒性效应及其机制也因此成为环境科学研究的热点之一。本研究以单细胞莱茵衣藻为模式生物,综合利用多种先进表征技术和分子生物学方法,围绕纳米银的生物吸收与转化、适应性响应以及相关分子机制开展了如下几个方面研究:
    利用液相还原成核和光照诱导颗粒组装的方法制备了粒径 20 nm左右的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰球形纳米银颗粒,其在暴露介质中稳定性高,不易发生团聚沉淀。在此基础之上综合利用纳米级二次离子质谱(NanoSIMS)、同步辐射X射线吸收光谱(XAS)和高角环形暗场扫描透射电镜技术(HAADF-STEM),并结合选区电子衍射和能谱分析,研究了暴露纳米银后莱茵衣藻细胞内银的分布和形貌特征以及赋存形态。NanoSIMS和  HAADF-STEM微区化学成像表明暴露纳米银后衣藻细胞壁膜间隙和细胞质区室中均存在明显的银富集。选区电子衍射晶体结构分析、能谱元素组成及 XAS形态分析证明壁膜间隙中富集的银为直径10-20  nm的纳米银颗粒,而在银离子暴露下则未观察到纳米银颗粒。在细胞质区室中银的分布和形态与银离子暴露相同,主要以 β-硫化银晶体和银巯基络合物形态存在。上述结果首次证明了纳米银颗粒能够直接进入莱茵衣藻细胞壁膜间隙,而细胞质内的银则是胞质外纳米银解离释放出银离子的吸收、硫化和区室化隔离所致。本研究通过综合利用先进谱学技术阐述了纳米银进入衣藻细胞的途径及其在胞内的转化与区室化机制,同时也为研究其他纳米材料的生物过程提供了可借鉴的研究方法。
    为阐明纳米银进入衣藻细胞和随后生物转化的分子机理,以及纳米银胁迫的生物适应性响应机制,本研究利用转录组测序技术分析了衣藻暴露无毒性效应剂量纳米银和银离子后细胞转录组的变化。结果表明纳米银和银离子暴露后编码细胞壁和鞭毛功能性组成蛋白的转录本明显降低,导致细胞壁疏松甚至破损,鞭毛消失。细胞壁结构的破坏也为纳米银颗粒穿透提供了有效途径。另一方面,银离子暴露时细胞内与硫代谢相关的部分基因表达量发生显著改变,而纳米银暴露时则无显著变化,这与我们在前面研究中观察到的纳米银以释放银离子方式在细胞质内硫化的过程相符。其中 CDO2和  RDP2等与有机态硫重复利用相关的基因出现上调,而硫酸根胞外吸收转运和叶绿体内同化还原生成巯基化合物(半胱氨酸、谷胱甘肽和植物络合素等)相关的基因并无显著变化,但半胱氨酸向蛋氨酸转化过程相关酶的编码基因出现下调。硫代谢过程的变化与细胞内银硫化过程的关系还需要进一步验证。此外,研究中发现纳米银和银离子暴露均可引起显著的莱茵衣藻细胞功能性缺铜和氧化应激反应。纳米银暴露时缺铜响应基因上调的持续时间较银离子暴露长,而银离子暴露引起的氧化应激较纳米银暴露更为明显。缺铜反应激活 CYC6和FDX5等一系列相关缺铜响应基因的表达,导致细胞内铜的过量累积。MSD3和  TRX类基因的显著变化分别与叶绿体和细胞质内的氧化应激反应有关,并且 MSD3上调幅度高达  1000倍以上,可以作为氧化应激反应的指示性基因。
    CRR1是衣藻细胞内缺铜响应基因的转录因子之一,其调控基因包括CYC6和 FDX5等。为明确缺铜反应在衣藻适应纳米银胁迫过程中的作用,我们获得了CRR1编码基因单碱基缺失突变株(crr1突变株)和回复株,以便与野生型进行对比实验。结果证明转录因子 CRR1缺陷可导致衣藻细胞在纳米银暴露条件下无法正常激活 CYC6和  FDX5等缺铜响应基因的表达,同时不会表现出细胞内铜的过量累积。转录因子 CRR1缺陷时纳米银在衣藻细胞中的累积及其半数抑制浓度并无显著变化,但是纳米银向银离子转化过程受到抑制,野生型衣藻细胞中一价银含量显著高于  crr1突变株。MSD3与缺铜响应基因表达趋势分析以及银离子毒性测试均证明莱茵衣藻细胞通过招募转录因子  CRR1调控的缺铜响应基因的表达以缓解纳米银释放出银离子对细胞产生的稳态破坏。本研究首次证实衣藻细胞铜稳态紊乱与纳米银生物转化和毒性效应的关系,为进一步阐明纳米银与生物相互作用的机理奠定基础。
英文摘要:     Silver  nanoparticles  (AgNPs)  are  widely  used  in  numerous  technologies  and incorporated  into   a  wide  array   of  consumer  products   due  to  their   antibacterial properties.  AgNPs embedded  in the  consumer  products are  expected  to make  their way during manufacture,  usage or disposal  into aquatic environment and  the amount is expected  to continue increasing.  The released AgNPs  will inevitably  interact with aquatic organisms, spurring  growing attentions on  the potential risk  of AgNPs to the environmen.  Therefore,  there  is a  considerable  effort  underway  to  understand  the environmental  behaviors  and toxicities  of  AgNPs  in  aquatic environments.  In  this study, a combination  of high-resolution techniques and  molecular biological methods was    employed    to    investigate   the    cellular    internalization    and    intracellular biotransformation of AgNPs  in the model  organism Chlamydomonas reinhardtii, and the adaptive responses and related mechanism in the algal cell under AgNP stress.
    AgNPs coated with  PVP in the diameter of~20    nm were synthesized  by liquid reduction  together   with  light-induced   self-assembly  method,   which  were   stable enough to  keep well dispersed  in the exposure  medium. Then a combination  of high resolution  imaging and  in situ  detection  spectroscopic techniques  was employed  to systematically  investigate  the  intracellular  localization,  morphology  and  chemical speciation   of  silver   in   the   cells  of   Chlamydomonas   reinhardtii,   a   unicellular freshwater green  alga, after exposure to  AgNPs. High resolution  secondary ion mass spectrometry (NanoSIMS)  and  high-angle annular  dark  field scanning  transmission electron microscopy  (HAADF-STEM) together  with energy  dispersive spectroscopy (EDS)  and  selected  area  electron  diffraction   (SAED)  collectively  confirmed  that AgNPs entered the periplasmic  space after cellular internalization into  the algal cells.
    Silver was  also found to  coexist with  sulfur inside  the cytoplasm in  both crystalline and amorphous  forms,  which were  further identified  as  β-Ag2S and  silver  thiolates with   synchrotron  X-ray   absorption  spectroscopy   (XAS).   In  combination,   these analyses  demonstrated  that   silver  inside  algae  was   attributed  to  the  uptake   and sequestration of  Ag+ ion  released from  AgNPs, which  was further  sequestrated into cellular compartments. This  study provides solid  evidence for particle internalization and  biotransformation  of  AgNPs after  interaction  with  algae,  and  also  a  valuable reference   for   understanding   the   interactions   of   nanoparticles    with   cells   and bio-macromolecules.
    To   understand  the   molecular  mechanisms   that   underlie  the   internalization, biotransformation  of  AgNPs, and  adaptive  responses  to  AgNPs  in  algal cells,  the transcriptome of  algae  exposed to  non-toxic  concentrations of  AgNPs and  Ag+  ion were monitored by  RNA-seq. There was an  obvious decrease of transcripts  encoding proteins that functioned  in the cell  wall and flagella,  engendering the loss  of flagella and less tight and  even broken of cell walls. The  increase of permeability of cell wall was  conducive   to   the  direct  penetration  of   AgNPs.   Genes  involved   in  sulfur metabolism  were not  significantly  altered after  exposure  to  AgNPs, whereas  some were  obviously  changed  for  the  exposure  to  Ag  ion.   This  was  in  line  with  the observation  that  sulfidation  of  Ag+  ion  dissolved  from  AgNPs  after  entering  the cytoplasm. CDO2  and RDP2,  relating to  the recycle  of sulfur in  organic molecules,were  upregulated  for  the  exposure  to  Ag  ion. Genes  involved  in  the  uptake  and translocation of sulfate and synthesis  of cysteine, glutathione and phytochelatins from sulfate were  in the  same level  with  the control,  while those  encoding enzymes  that catalyzed  the synthesis  of  methionine  from cysteine  were  down regulated.  Further studies  are  necessary to  investigate  the  relationship  between  the  change  of  sulfur metabolism and  sulfidation of Ag.  Moreover, both exposures of  AgNPs and Ag+ ion induced  copper  deficiency  response   and  oxidative  stress  in   the  algal  cells.  The upregulations of  copper deficiency responsive  genes sustained a  relative longer  time for the  exposure to AgNPs  than that of Ag+ ion, while  the oxidative stress  was more obvious for the exposure  to Ag+ ion than that  of AgNPs. Copper deficiency activated the  upregulations of  a  set  of relative  genes  including CYC6  and  FDX5  and et  al,
resulting in  an  excessive accumulation  of copper  in the  algal cells.  The changes  of MSD3 and TRX indicated the oxidative stress in  the chloroplast and cytosol. The fold change  of  MSD3 reached  up  to  1000,  and  therefore  it was  considered  to  be  one sentinel gene to indicate oxidative stress.
    CRR1 is  one of  the transcription  factors that  regulate the  expressions of  CYC6 and  FDX5  and  et  al.  To  elucidate  the  role  of  copper  deficiency response  in  the adaptive responses to AgNPs stress, the crr1  mutant with complete deficient of CRR1 due  to  single  nucleotide deletion  of  the  encoding  regions,  and  the  complemented strain  were obtained  to  make  a comparative  study  with the  wild  type.  The results indicated that defect  of transcription factor  CRR1 made the algal  cell incompetent to activate  the expressions  of  copper deficiency  responsive  genes  such as  CYC6  and FDX5, and no excessive accumulation of copper in the algal cell.  The defect of CRR1 did not  affect  the accumulation  of Ag  in the  algal  cell and  EC50 value  of  AgNPs,
while  it  reduced  the   transformation  of  AgNPs  to  Ag  ion,   indicating  the  higher accumulation amount of monovalent Ag  in the wild type than that in  the crr1  mutant.
    The trends  of expressions of  MSD3 and copper  deficiency responsive genes  and the Ag  ion   toxicity  assay  confirmed   that  copper  deficiency   responsive  genes   were responsible  for  maintaining  homeostasis  on   perturbations  caused  by  Ag  ion  and function in algal  resistance to the  toxic effects of Ag  ion released from  AgNPs. This study confirmed  the  relationship between  the disruption  of copper  homeostasis  and biotransformation and toxic  effects of AgNPs in  algal cells, which was  conduicive to advance the understand of mechanisms of AgNP-biological interactions.
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/37021
Appears in Collections:环境化学与生态毒理学国家重点实验室_学位论文

Files in This Item:
File Name/ File Size Content Type Version Access License
王松山--莱茵衣藻对纳米银的生物吸收与转化及响应机理研究.pdf(3841KB)学位论文--限制开放 联系获取全文

Recommended Citation:
王松山. 莱茵衣藻对纳米银的生物吸收与转化及 响应机理研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2016.
Service
Recommend this item
Sava as my favorate item
Show this item's statistics
Export Endnote File
Google Scholar
Similar articles in Google Scholar
[王松山]'s Articles
CSDL cross search
Similar articles in CSDL Cross Search
[王松山]‘s Articles
Related Copyright Policies
Null
Social Bookmarking
Add to CiteULike Add to Connotea Add to Del.icio.us Add to Digg Add to Reddit
所有评论 (0)
暂无评论
 
评注功能仅针对注册用户开放,请您登录
您对该条目有什么异议,请填写以下表单,管理员会尽快联系您。
内 容:
Email:  *
单位:
验证码:   刷新
您在IR的使用过程中有什么好的想法或者建议可以反馈给我们。
标 题:
 *
内 容:
Email:  *
验证码:   刷新

Items in IR are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

 

 

Valid XHTML 1.0!
Copyright © 2007-2017  中国科学院生态环境研究中心 - Feedback
Powered by CSpace